对同一张组织切片上的两种或多种抗原进行免疫组化定位，有多种酶学方法可供选择。概括起来可分为两大类： 
用相同的酶系统、不同的酶作用底物对每种抗原进行检测，或用不同的酶系统及其相应的底物，对每种抗原进行检测。 
目前Vector公司所提供的可广泛选择的VECTORSTAIN® ABC kit试剂盒及底物试剂盒，上述两种方法都适用。 
Vector开发的许多独特的底物尤其适用于多抗原标记。通常，过氧化物酶底物能产生更稳定、更密集的有色沉积物而能对抗原进行精确定位；碱性磷酸酶底物较弥散；葡萄糖氧化酶相比而言灵敏度较低，但当使用高浓度的一抗时，也可作为第二种标记对抗原进行定位。 

双抗原染色流程图 

双抗原染色实验步骤 

1.组织标本制备。脱蜡、水化、抗原修复（可根据一抗说明书推荐方法进行操作）。 
2.在蒸馏水中清洗5分钟。 
3.如存在内源酶活性，可采用适当方法以消除内源酶的作用。（如3％H2O2-甲醇液中浸泡10分钟，以消除内源性过氧化氢酶的作用）。 
4.用PBS洗2 分钟/次×3次（也可使用其他缓冲液）。 
5.Avidin/biotin封闭。 如有需要，可进行Avidin/Biotin封闭（Avidin/Biotin 封闭试剂盒，目录号 SP-2001）。在Avidin溶液中孵育15分钟。用缓冲液清洗，然后在Biotin 溶液孵育15分钟。用PBS洗2 分钟/次×3次。如已设置适当对照，背景不需考虑时，也可省去此步。 
6.蛋白封闭。用含5%正常血清的缓冲液孵育20分钟。或在10%的正常血清中孵育5-10分钟。 
7.一抗。甩去多余封闭液，滴加适当浓度的一抗（5%正常血清稀释- VECTASTAIN® kit），室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。在蒸馏水中清洗5分钟。 
8.PBS洗2 分钟/次×3次。 
9.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需升高生物素化二抗的浓度。 
10.PBS洗2 分钟/次×3次。 
11.加入ABC复合物（预先制备的VECTASTAIN® ABC试剂）。孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需提高试剂浓度。 
12.PBS洗2 分钟/次×3次。 
13.底物。用适当的酶底物进行孵育（可在显微镜下观察至显色最佳）。请根据底物试剂盒中推荐的时间做参考。 
14.PBS洗2 分钟/次×3次。 
15.（此步起，为对第2种抗原进行染色标记）Avidin/biotin封闭。此步可防止第2套标记试剂与第1套标记试剂相互作用。在蒸馏水中清洗5分钟。 
16.蛋白封闭。用含5%正常血清的缓冲液孵育20分钟。或在10%的正常血清中孵育5-10分钟。用PBS洗2 分钟/次×3次（也可使用其他缓冲液）。 
17.一抗。甩去多余封闭液，滴加适当浓度的一抗（5%正常血清稀释- VECTASTAIN® kit），室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（或适当孵育时间）。 
18.PBS洗2 分钟/次×3次。 
19.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需升高生物素化二抗的浓度。 

20.加入ABC复合物（根据说明书预先制备的VECTASTAIN® ABC试剂）。孵育30分钟。若孵育5-10分钟，需提高试剂浓度。 

21.PBS洗2 分钟/次×3次。 
22.底物。用适当的第2种酶底物进行孵育（可在显微镜下观察至显色最佳）。请根据底物试剂盒中推荐的时间做参考。 23.用自来水冲洗5分钟。 
24.复染、盐酸酒精分化、封片、镜下观察。

优质免疫化学检测酶底物 
       Vector公司能提供过氧化物酶底物、碱性磷酸酶底物和葡萄糖氧化酶底物，以及DuoLuX 化学发光或荧光底物。可用于碱性磷酸酶，过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。均为浓缩型，试剂盒内包括能配置成300ml工作液所需的所有试剂成分，足以染色3000-6000张片。试剂盒成分稳定，4℃可保存一年。酶底物反应物有可溶性和非可溶性，适合IHC、WB、ISH、ELISA等多种免疫化学检测方法。

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