该免疫沉淀实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。
所需试剂
细胞准备:
•Tris 缓冲盐溶液（TBS）. 使用 10x TBS, pH 7.5 (1.0M Tris HCl, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到 可在室温下保存一个月 .
•裂解缓冲液. 含有0% 合适洗涤剂的TBS、1mg/ml的 牛血清白蛋白 BSA、合适的蛋白质酶抑制剂.
•稀释缓冲液. 与裂解缓冲液相同, 除去蛋白质酶抑制剂.
•用于裂解物预处理的琼脂糖轭合物. 预吸收裂解物以移除与一抗二抗的非特异结合. 用来自同一物种的琼脂糖标准 IgG做一抗, 抗宿主的二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.
一抗:
•一抗的对照. 对于多抗血清, 使用来自同一物种的未免疫的血清. 单克隆抗体使用相同亚型和纯度.
•免疫沉淀的琼脂糖轭合物. 使用抗一抗宿主的琼脂糖二抗. 用稀释缓冲液1:1制备悬浮液.
•Tris 缓冲液. 制备05M 的Tris 缓冲液, pH 6.8.
•2x SDS-PAGE 样品缓冲液
•2-巯基乙醇
实验步骤
1.将5 x 107 细胞置于裂解缓冲液中, 在冰上孵育30-60 分钟制备裂解液.
2.涡旋裂解液后置于离心机上250 x g离心10分钟, 除去细胞核留下上清液.
3.将上清液于100,000 x g离心30分钟, 或者微型离心机10,000 x g 离心30分钟, 再取上清液.
4.加入琼脂糖轭合物来预处理裂解液以除去非特异的蛋白结合. 每200 µl 裂解液使用10µl 对照琼脂糖. 于4ºC下震荡1小时. 200 x g离心. 留上清液.
5.向两个微离心管中各加入 200 µl 含有抗原的预处理了的裂解液. 用稀释缓冲液将体积补至 1 ml.
6.向一个离心管中加入一抗. 对于多克隆抗血清或腹水加入5-5 µl一抗. 对组织培养上清液加入 10-100 µl一抗. 向第二个离心管加入同等体积的一抗对照. 冰上孵育1小时.
7.做免疫沉淀时每个管加入50µl琼脂糖轭合物. 4ºC下轻微震荡1小时.
8.于200 x g离心1分钟或微型离心机离心5秒钟. 用移液管小心移出上清液. 用1 ml 稀释缓冲液轻缓重新悬浮底部团块. 重复洗涤. 先用TBS洗涤最后用5 M Tris, pH 6.8洗涤.
9.如上所示再次离心. 加入20-50 µl 样品缓冲液. 混合后在100 ºC加热5分钟. 稍微微离心一下, 将上清液直接用于非还原性电泳SDS-PAGE. 如果需用还原性条件, 将上清液转移到新管中加入5% 2-巯基乙醇. 如上混合加热.
10.电泳蛋白质混合物. 染色凝胶或免疫印迹 (使用我们 Western Blot 的实验方案) 显色. 显现的条带包括抗原的多肽链和使用的抗体.
* 怎样选择正确的珠子:
物种免疫球蛋白亚型Protein AProtein G
人 IgG1 结合力强 结合力强
人 IgG2 结合力强 结合力强
人 IgG3 没有结合力 结合力强
人 IgG4 结合力强 结合力强
人 IgM 使用抗 人 IgM
人 IgE 没有结合力 结合力弱
人 IgA 没有结合力 结合力弱
小鼠 IgG1 结合力弱 结合力强
小鼠 IgG2a 结合力强 结合力强
小鼠 IgG2b 结合力中等 结合力中等
小鼠 IgG3 结合力弱 结合力弱
小鼠 IgM 使用抗小鼠 IgM
大鼠 IgG 没有结合力 结合力弱
大鼠 IgG2a 没有结合力 结合力强
大鼠 IgG2b 没有结合力 结合力中等
大鼠 IgG2c 结合力弱 结合力中等
鸡的 所有亚型 没有结合力 没有结合力
牛的所有亚型结合力中等 结合力强
山羊的所有亚型没有结合力 结合力中等
豚鼠所有亚型结合力强 结合力中等
仓鼠所有亚型结合力弱 结合力中等
马的所有亚型结合力弱 结合力强
猪的所有亚型结合力弱 结合力中等
兔的所有亚型结合力强 结合力中等
绵羊的所有亚型没有结合力 结合力强
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